Themenschwerpunkte sind die Gründung und Entstehung des Dorfes, theologische Aspekte und Lebensweise der ersten Hugenotten sowie die wirtschaftliche und demografische Entwicklung zur Stadt anhand ausgewählter Handwerks- und Gewerbezweige.

Die Themen der Dauerausstellung werden durch regelmäßige Sonderausstellungen, Veranstaltungen, Aktionen und museumspädagogische Angebote ergänzt.

Das „Haus zum Löwen“ war ursprünglich das erste Gasthaus der hugenottischen Siedler; darauf wird bereits im Eingangsbereich mit einer „Äppelwoistub“ verwiesen. In jeder Abteilung des Museums stehen prominente Isenburger für ihre Zeit oder besondere Schwerpunkte der Stadtgeschichte: Von Siedlungsgründer Graf Johann Philipp zu Ysenburg, über die Sänger Franz Völker und Anny Schlemm bis zum Astronauten Thomas Reiter. 300 Jahre Stadtgeschichte in drei Stockwerken bieten eine Zeitreise mit vielen Möglichkeiten, selbst einmal etwas auszuprobieren.